酵母水解物中小肽的測(cè)定方法及意義

　　酵母中含有三類大分子：蛋白質(zhì)、核酸和多糖，其中蛋白質(zhì)幾乎占了干物質(zhì)一半以上的含量，必需氨基酸充足，呈味氨基酸豐富，總谷氨酸含量在6%以上，色氨酸在1%以上，所以酵母水解物誘食性絕佳。

　　新鮮酵母中的蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的肽類物質(zhì)，曾引起專家和配方師們的廣泛關(guān)注與討論，那么酵母水解物中的小肽具體含量應(yīng)該是多少?是否可以精確、重復(fù)檢測(cè)?以下內(nèi)容是由湖北海宜為大家整理的小肽的定義及檢測(cè)方法：

　　一、什么是小肽?

　　肽是蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸過(guò)程中的中間產(chǎn)物，通常將大于20個(gè)的氨基酸殘基構(gòu)成的肽稱為多肽(Poly-peptide)，2-20個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽稱為寡肽(Oligopeptide)，而將僅由2個(gè)或3個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的二肽和三肽稱之為小肽(Small peptide)。(參考《動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)》第三版)

　　二、小肽含量的檢測(cè)方法：

　　1、大豆肽粉，國(guó)標(biāo)：GB/T 22492-2008

　　原理：采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分相對(duì)分子質(zhì)量大小的差別進(jìn)行分離，在肽鍵的紫外吸收波長(zhǎng)220nm條件下檢測(cè)，使用凝膠色譜法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對(duì)色譜圖及其數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算得到大豆肽的相對(duì)分子質(zhì)量大小及分布范圍。

　　本法適用于以大豆粕或大豆蛋白等為原料，用酶解或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，相對(duì)分子質(zhì)量在5000以下，主要成分為肽的粉末狀物質(zhì)。

　　2、海洋魚低聚肽粉，中國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：QB/T 2879-2007

　　2.1  低聚肽

　　方法原理：低分子量的蛋白質(zhì)水解物(包含低聚肽及游離氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液;高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在三氯乙酸溶液中易沉淀。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質(zhì)，收集離心清液。按照GB/T5009.5規(guī)定的方法測(cè)定離心清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量，清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量減去游離氨基酸含量即得到低聚肽的含量。

　　該法僅可以粗略測(cè)出樣品中的三氯乙酸可溶性氮，并且不能扣除核酸中的含氮堿基對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，更加不能精確檢測(cè)二肽、三肽具體含量是多少。

　　2.2  相對(duì)分子質(zhì)量小于1000u的蛋白質(zhì)水解物所占比例(高效凝膠過(guò)濾色譜法)

　　方法原理：相對(duì)分子質(zhì)量小于1000u的蛋白質(zhì)水解物(包括低聚肽和少量游離氨基酸)所占比例，采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進(jìn)行分離，在肽鍵的紫外吸收波長(zhǎng)220nm條件下檢測(cè)，使用凝膠色譜測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對(duì)色譜圖及其數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算得到蛋白質(zhì)水解物的相對(duì)分子質(zhì)量大小及分布范圍，進(jìn)而得到相對(duì)分子質(zhì)量小于1000u的蛋白質(zhì)水解物(包括低聚肽和少量游離氨基酸)所占比例。

　　本法適用于以海洋魚皮、魚骨或魚肉為原料，用酶解法生產(chǎn)的，相對(duì)分子質(zhì)量低于1000的低聚肽(短肽)為主要成分的粉末。

　　三、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法

　　蛋白質(zhì)的含量測(cè)定是生化藥品研究最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的測(cè)定方法有凱氏定氮法、福林酚法、雙縮脲法、BCA法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法及熒光法。《歐洲藥典》6.0版、《英國(guó)藥典》2009年版及《美國(guó)藥典》32版附錄中均收載了上述七種方法，《中國(guó)藥典》2005年版三部附錄僅收載了上述測(cè)定方法中的前三種。以下僅供參考：

　　3.1 凱氏定氮法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)為含氮的有機(jī)化合物，當(dāng)與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時(shí)使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以氮轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。凱氏定氮法雖耗時(shí)較長(zhǎng)，但它是蛋白質(zhì)測(cè)定方法中最經(jīng)典的測(cè)定方法，本法所測(cè)的結(jié)果為蛋白質(zhì)絕對(duì)濃度而非相對(duì)濃度，可用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

　　3.2  福林酚法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與 Cu 2 + 螯合形成蛋白質(zhì)- 銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

　　3.3  雙縮脲法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的兩個(gè)以上肽鍵在堿性溶液中與 Cu 2 + 形成紫紅色絡(luò)合物， 在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

　　3.4  Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)：

　　原理：考馬斯亮藍(lán)(CBB)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/ml，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。

　　四、小結(jié):

　　小肽 (二肽、三肽)作為蛋白質(zhì)的主要消化產(chǎn)物，在氨基酸消化、吸收和代謝中起著重要作用。但酵母水解物與小麥水解蛋白、大豆肽粉等專屬的肽類蛋白原料不同，它還含有核酸、多糖等其他大分子(約30%以上)。而且小肽的含量與酶解所用的酶制劑、添加比例、酶解時(shí)間、溫度、pH值等均有一定的相關(guān)性，檢測(cè)時(shí)在樣品處理、國(guó)標(biāo)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)方法等方面，尚缺乏系統(tǒng)、精確、可重復(fù)性的檢測(cè)方法方面的公開(kāi)報(bào)道。而且，酵母水解物作為一種強(qiáng)誘食性的蛋白原料，只有以新鮮酵母為原料，經(jīng)充分水解、干燥后才能呈現(xiàn)特有的鮮味，品控重點(diǎn)應(yīng)以產(chǎn)品使用價(jià)值為目標(biāo)，以《飼料原料目錄》中強(qiáng)制標(biāo)識(shí)要求為根據(jù)。

　　因此，我們暫時(shí)不建議將小肽作為酵母水解物的常規(guī)指標(biāo)加以評(píng)估，而應(yīng)該將方便飼料企業(yè)檢測(cè)、且能反應(yīng)出產(chǎn)品品質(zhì)的指標(biāo)，如粗蛋白、氨基酸態(tài)氮、核酸、甘露聚糖、水分、灰分等作為常規(guī)品控指標(biāo)。

　　以上觀點(diǎn)僅代表湖北海宜，不足之處還望同行及用戶多多包涵，并歡迎共同探討!